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摘要：目的采用超高液相色谱四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS），对活血止痛胶囊化学成分进行快速分析。方法采用WatersAcquityUPLCBEHC18色谱柱（mm×2.1mm，1.7μm），以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈为流动相进行梯度洗脱，体积流量0.4mL/min；分别在正、负离子模式下采集数据，Masslynx4.1TM软件分析处理数据。结果在正、负离子模式下共鉴定出个化合物，包括萜类、皂苷类、有机酸类、苯酞类和其他类，并对化合物的药材来源进行了归属。结论建立的方法能够系统、快速、准确地鉴定活血止痛胶囊多种化学成分，本研究为活血止痛胶囊质量评价指标选择及药效物质基础深入研究提供了参考。

活血止痛胶囊收载于《中国药典》年版一部，是由当归、三七、醋乳香、冰片、土鳖虫、煅自然铜6味中药组成，具有活血散瘀、消肿止痛功效，用于跌打损伤、淤血肿痛，临床主要用于治疗急、慢性软组织损伤类疾病[1]。活血止痛胶囊临床疗效确切，但目前对活血止痛胶囊的药效物质基础研究未见报道，有关该复方的化学组成研究报道也多局限于单一指标的含量测定或单味药成分的定性分析[2-9]，致使其质量标准控制指标较单一，因此，全面分析活血止痛胶囊的化学成分显得尤为重要。

近年来，液质联用在中药复方物质组辨识中发挥着重要的作用，超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术具有“三高”（高效率、高灵敏度、高分辨率）的特点，同时还能得到化合物的相对分子质量、元素组成以及离子碎片等信息，可快速确定化合物的结构[10]。本实验采用超高液相色谱四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术，对活血止痛胶囊的化学成分进行定性分析，使用MasslynxTM4.1软件进行数据分析，结合色谱行为和质谱信息及相关文献，共鉴定或表征了个化合物，主要为萜类化合物33个、皂苷类化合物40个、有机酸类化合物13个、苯酞类化合物22个和5个其他类成分。为进一步阐明活血止痛胶囊药效物质基础及质量控制指标的选择提供依据。

1仪器与试药

1.1仪器

AcquityUPLC超液相色谱仪、XevoG2Q-TOF高分辨质谱（美国Waters公司）；AcquityUPLCBEHC18（mm×2.1mm，1.7μm）色谱柱（美国Waters公司）；AB-N电子天平（德国Meteler公司）；BT25S电子天平（德国Sartorius公司）；超声波清洗仪（宁波新芝生物科技公司）。

1.2试药

对照品阿魏酸（批号-）、咖啡酸（批号-）、人参皂苷Rg1（批号-）、人参皂苷Rb1（批号-）、人参皂苷Re（批号-）、三七皂苷R1（批号-）、人参皂苷Rd（批号-）购自中国食品药品检定研究院；所有对照品质量分数均大于98.0%。色谱纯甲醇、乙腈、甲酸，购自天津康科德科技有限公司；纯净水购自杭州娃哈哈饮用水有限公司；活血止痛胶囊购自江西百昌诺药业有限公司（批号）。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：AcquityUPLCBEHC18（mm×2.1mm，1.7μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱条件为0～3min，92%～80%A；3～22min，80%～35%A；22～26min，35%～25%A；26～27min，25%～5%A；27～30min，5%A；30～31min，5%～92%A；31～35min，92%A；柱温45℃；体积流量0.4mL/min；进样量2μL。

2.2质谱条件

XevoG2Q-TOF高分辨质谱仪，配备电喷雾离子源（ESI），正、负离子2种模式下进行监测，毛细管电压正离子模式3.0kV，负离子模式2kV。离子源温度℃，样品锥孔电压30V，锥孔气体积流量50L/h，氮气脱气温度℃，脱气体积流量L/h，扫描范围m/z50～，内参校准液亮氨酸脑啡肽用于相对分子质量实时校正。

2.3对照品溶液的制备

分别称取对照品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、咖啡酸、阿魏酸适量，精密称定，加甲醇分别制成每毫升含0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.mg的混合对照品溶液。

2.4供试品溶液的制备

取活血止痛胶囊10粒，装量差异检查后的内容物约2.0g（批号），精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇20mL，称定质量，超声提取30min，放冷，用70%甲醇溶液补足减失质量，0.22μm微孔滤膜滤过，得样品溶液供UPLC-Q-TOF/MS检测分析。

2.5活血止痛胶囊样品分析

对活血止痛胶囊样品溶液进行检测分析，所含各化学成分的色谱峰得到了较好的分离。正、负离子模式下，活血止痛胶囊样品的色谱图（BPI）见图1。

2.6UPLC-Q-TOF/MS成分鉴定

通过与对照品比对，没有对照品的化合物根据碎片离子结合文献数据和公共数据库（如MassBank、Chemspider），分析质谱裂解规律，在活血止痛胶囊样品中共鉴定得到个化合物。其中40个皂苷类成分，来源于三七；33个萜类成分，来源于醋乳香；22个苯酞类成分，主要来源于当归；13个有机酸类成分，主要来源于当归；5个其他类成分。UPLC-Q-TOF/MS数据见表1。

2.7主要化合物鉴定与归属

2.7.1有机酸类化合物主要存在于当归中，其中酚酸类化合物主要为芳香烃中苯环上氢原子被羟基所取代形成，是芳烃的含羟基衍生物，在质谱中易丢失羟基-COOH、CO2和CO等小分子而产生碎片离子峰[11]。以阿魏酸为例，在负离子模式下，显示其准分子离子[M－H]?，m/z.，其特征碎片离子m/z，是准分子离子脱去1分子CH3产生，m/z是准分子离子脱去CO2形成，m/z是准分子离子在脱去CH3基础上，继续脱去CO2形成，通过与对照品比较，鉴定为阿魏酸。裂解途径见图2。

2.7.2皂苷类化合物皂苷类化合物主要存在于三七中，结构中含有葡萄糖、鼠李糖、及阿拉伯糖等多个糖基取代，在质谱中容易逐级丢失产生一系列碎片离子。以人参皂苷Rb1为例，在负离子模式下，显示其准分子离子m/z7.[M－H]?，其特征碎片离子为m/z、m/z、m/z，是准分子离子峰失去4分子葡萄糖而产生，通过与对照品及相关文献[12-13]比对，鉴定为人参皂苷Rb1。裂解途径见图3。

2.7.3苯酞类化合物主要来源于药材当归，苯酞类化合物容易侧链断裂脱烯（CnH2n），产生[M－C2H4＋H]+、[M－C3H6＋H]+、[M－C4H8＋H]+等碎片离子。以Z-藁本内酯为例，在正离子模式下，显示其准分子离子峰[M＋H]+，m/z.2，其特征碎片离子有m/z、、。m/z是准分子离子峰发生中性丢失1分子H2O，m/z是m/z失去CO而产生，继而发生中性丢失C2H4形成m/z。通过文献比对[14]，鉴定为Z-藁本内酯。裂解途径见图4。

2.7.4萜类化合物萜类化合物主要来源于药材醋乳香，有五环三萜、四环三萜、大环二萜等。在正离子模式下，四环三萜类化合物的裂解方式主要表现为C-3、C-16位取代基发生变化，例如丢失1分子H2O或丢失1分子CH3COOH；五环三萜类化合物主要表现为在E环的C-28位以麦氏重排的方式缓慢的进行裂解。在负离子模式下，四环三萜C-16位易丢失1分子H2O，C-20位丢失1分子CO2，C-10位丢失1分子CH3CH2COOH；五环三萜类化合物容易失去1个氢质子，形成独特的前提离子。以11α-羰基-β-乳香酸为例，在正离子模式下，显示其准分子离子峰m/z.[M＋H]?，，其特征碎片离子m/z、、、。m/z是准分子离子失去1分子H2O而产生，再失去1分子C7H12产生m/z。m/z是准分子离子失去1分子H4O2而产生，再失去1分子CO产生m/z，再失去1分子H2O产生m/z。根据裂解规律及与文献比对[15-16]，鉴定为11α-羰基-β-乳香酸。裂解途径见图5。

3讨论

为了更加全面地研究活血止痛胶囊中主要化学成分，对分析条件进行了优化，分别对提取溶剂、提取方式、提取时间及流动相进行了考察，结果表明70%甲醇超声30min为最佳提取条件，流动相采用甲酸水（水相）-甲酸乙腈（有机相），可以使化合物的峰形得到改善。活血止痛胶囊中的化学成分种类较多，为了全面对其化合物进行鉴定，实验采用正、负离子2种模式进行分析。

当归是活血止痛胶囊中的君药，有效成分挥发油可扩张血管，缓解血管痉挛，抑制心肌细胞肥大，抗心律失常，其中藁本内酯可干扰细胞内钙离子代谢[17]；活血止痛胶囊中的有效成分三七总皂苷抑制血小板聚集、止血、增强免疫系统，抑制肿瘤等生物活性[18-20]；土鳖虫辅助当归增强其活血散瘀；醋乳香活血定痛、消肿生肌；自然铜具有接骨止痛，二者协同促进骨折愈合和组织修复作用[21]；冰片可以促进有效成分传递到身体各个部位发挥作用。

本实验采用UPLC-Q-TOF/MS技术对活血止痛胶囊的体外主要化学物质基础进行研究，共鉴定出种化学成分，主要为皂苷类、萜类、苯酞类和有机酸类等成分。并对化合物来源进行归属，40个皂苷类成分主要来源于药材三七；33个萜类成分主要来源于药材醋乳香，主要为五环三萜、四环三萜和大环二萜；22个苯酞类成分主要来源于药材当归，内酯类化合物占大部分；13个有机酸类成分主要来源于药材当归，主要为脂肪酸和酚酸。本实验全面对活血止痛胶囊的主要化学成分进行辨识，阐明活血止痛胶囊的主要化学物质组，为进一步明确其药效物质基础和质量控制提供了参考。实验中也存在不足之处，活血止痛胶囊中挥发性成分并不能完全用此方法可以辨识得出，所以后期将会采用GC-MS的方法对当归中的挥发油、醋乳香和冰片进行分析；自然铜属于矿物药、土鳖虫属于动物药此方法无法辨识其化学成分。对于未鉴定出的化合物，还有待深入研究。

参考文献（略）

来源：张纪红，吴卫东，刘建庭，许浚，黄飞奇，刘丽，张铁军，陈常青，刘昌孝．基于UPLC-Q-TOF/MS技术活血止痛胶囊化学成分的快速分析[J].中草药,,51(12):-.