北京治疗白癜风哪个医院较好 https://jbk.39.net/yiyuanzaixian/bjzkbdfyy/

摘要：目的探究大黄不同炮制品对阿托伐他汀（ATS）的增效减毒作用。方法通过人肝脏L02细胞实验考察生、酒、熟大黄提取物与ATS联用后的保肝作用，从中筛选出二者联用后保肝作用最优的炮制品提取物。通过人肝癌HepG2细胞实验确定该炮制品提取物的有效调脂剂量范围；基于SD大鼠高脂血症模型，通过测定血脂和转氨酶水平、相关氧化应激参数，检测肝脏组织病理切片对最优提取物和ATS联用的调脂和保肝作用进行整体评价。结果3种大黄炮制品中酒大黄醇提物可显著提高L02细胞存活率，对ATS所致L02细胞损伤的保护效果最好；同时酒大黄醇提物也可有效降低HepG2细胞内总胆固醇（TC）和三酰甘油（TG）水平；ATS与酒大黄醇提物的保肝配比和调脂配比（质量比）分别为1∶6.7～1∶9.0和1∶35.8～1∶71.6。酒大黄醇提物与ATS联用后可降低高脂血症大鼠的血脂水平和肝脏中脂质含量；使大鼠血清中丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平显著降低，肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）活力显著增强，丙二醛（MDA）水平显著降低；且高剂量酒大黄醇提物与ATS联用组可显著抑制炎细胞浸润和胆管增生。结论酒大黄醇提物能显著改善ATS引发的肝功能损伤，而且能增强ATS对高脂血症大鼠的调脂治疗效果，发挥减毒增效的作用。

高脂血症（hyperlipemia）是脂肪代谢紊乱的一种常见疾病，是动脉粥样硬化发病的主要因素，可引起严重的心脑血管疾病，同时也可导致非酒精性脂肪肝（non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD）的发生[1]。脂代谢功能障碍使高脂血症患者肝脏的负担增加，对药物等外界因素的刺激更为敏感，更易发生肝损伤等肝脏病理变化。

阿托伐他汀（atorvastatin，ATS）是第3代他汀类降脂药，疗效确切，应用广泛。ATS可通过降低总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和载脂蛋白B（apoB）水平治疗家族性和非家族性高胆固醇血症以及混合型高脂血症。但是其用于降脂治疗时可引起肝功能生化异常。服用ATS剂量为10、20、40、80mg/d时对应的肝功能异常发生率分别为0.2%、0.2%、0.6%、2.3%[2-4]，说明ATS所致肝功能异常的发生率与其用药剂量有明确的相关性。ATS所致肝损伤多表现为剂量依赖性的血清转氨酶升高，常伴有肝脏肿大、黄疸、直接胆红素升高和凝血酶原时间延长等。研究表明[5]ATS可能是通过竞争性抑制3-羟基-3-甲基戊二酞辅酶A（HMG-CoA）还原酶，进而激活Caspase-3、8、9通路，引起肝细胞染色体DNA断裂，使细胞形态产生变化，最终导致肝细胞的凋亡，即发生肝细胞型肝损伤。由于ATS存在肝毒性的隐患，可能使高脂血症患者肝脏病变的风险增加，限制了ATS在临床的应用。

大黄为蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.、唐古特大黄RheumtanguticumMaxim.exBalf.或药用大黄RheumofficinaleBaill.的干燥根和根茎，主要含有蒽醌类、蒽酮类、二苯乙烯类、鞣质类、有机酸类、多糖类等成分，临床常用的炮制品有生大黄、酒大黄和熟大黄等，炮制可改变大黄化学成分的含量或组成，从而影响其药理作用[6]。大黄临床常用于治疗肝炎、肝纤维化等肝胆类疾病和血脂异常等代谢类疾病[7-8]，也有将大黄与他汀类药物联合以增强调脂效果的应用案例。但目前与他汀类药物联用的大黄炮制品种类和提取方式并不明确，缺乏大黄不同炮制品提取物与他汀类药物联用后药效差异的相关研究，因此本研究通过细胞实验筛选得到与ATS联用后保肝和调脂作用均较优的大黄炮制品提取物及其配比关系，作为动物给药剂量的设置依据，通过动物实验从整体水平验证及评价该大黄炮制品提取物对ATS的减毒增效作用，为二者在临床上更合理地应用提供实验依据。

1材料

1.1仪器

Boxun超净工作台（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；CO2培养箱、Pico17高速离心机（美国赛默飞世尔科技公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；循环水式多用真空泵（上海知信实验仪器技术有限公司）；TS2R倒置显微镜（Nikon仪器有限公司）；多功能酶标仪（德国BMGLabtech公司）。

1.2试药

生大黄（批号）、酒大黄、熟大黄（酒大黄和熟大黄由同一批生大黄炮制而成）均购于北京本草方源药业有限公司，经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定符合《中国药典》年版[9]标准。

DMEM高糖培养基、青霉素链霉素混合液（美国Gibco公司）；胎牛血清（AniimalBloodWare公司）；0.25%含EDTA胰酶（美国Corning公司）；混合型高脂血症大鼠模型饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司）；ATS（上海麦克林生化科技有限公司，批号C）；三酰甘油（TG）、TC、LDL-C、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒，南京建成生物制品研究所；BCA、丙二醛（MDA）、蛋白浓度测定试剂盒，南京凯基生物科技有限公司；羧甲基纤维素钠（CMC-Na），天津市福晨化学试剂厂；油酸（OA）、棕榈酸（PA），美国Sigma公司。

1.3细胞

人肝脏L02细胞、人肝癌HepG2细胞（北京北纳创联生物技术研究院）。

1.4动物

SPF级雄性SD大鼠，体质量（±10）g，由斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供，许可证号为SCXK（京）-。

2方法

2.1大黄提取物的制备

取生大黄、酒大黄、熟大黄适量，分别加入10倍量水或70%乙醇，回流提取2次，每次1.5h，滤过，合并滤液，浓缩，减压干燥，得生大黄、酒大黄、熟大黄水提物和醇提物，其中总蒽醌、游离蒽醌质量分数见表1。

2.2大黄提取物对ATS所致L02细胞损伤的保护作用

取对数生长期的L02细胞接种于96孔培养板中，每孔的接种密度为1.5×个，接种24h后，同时以0.11mg/mL（μmol/L）ATS和0、0.25、0.50、0.75、1.00mg/mL生、酒、熟大黄水提物或醇提物作用于细胞36h，去除各组培养基，每孔分别加入μL10%MTT工作液，同时选取一些未接种细胞的孔，向其中加入10%MTT工作液作为空白孔。继续培养4h后，去除各孔10%MTT工作液，每孔分别加入μLDMSO，振荡后用酶标仪于nm波长处测定各孔的吸光度（A）值，计算细胞存活率。

存活率＝(A药物―A空白)/(A对照―A空白)

2.3酒大黄醇提物和ATS联用对L02细胞转氨酶水平的影响

取对数生长期的L02细胞接种于6孔培养板中，每孔的接种密度为6×个，接种24h后，同时以0.11mg/mLATS和0、0.25、0.50、0.75、1.00mg/mL酒大黄醇提物作用于细胞36h，将培养液收集到EP管中，0r/min离心10min，按照试剂盒说明取上清液检测各组培养液中ALT、AST水平。

2.4酒大黄醇提物和ATS联用对HepG2肝脂肪变性细胞内TG、TC水平的影响

取对数生长期的HepG2细胞接种于6孔培养板中，每孔的接种密度为4×个，接种24h后以0.75mmol/L（OA-PA2∶1）脂质诱导液造模24h，然后以0.mg/mL（25μmol/L）ATS分别和酒大黄醇提物0.10、0.25、0.50、0.75、1.00mg/mL联合作用于细胞24h，吸去培养基，PBS清洗1次，每孔加入μLRIPA裂解液，于冰水浴上裂解完全后将裂解液收集到EP管中，按照试剂盒说明取裂解液检测细胞内TG、TC水平，并以BCA法测定各孔蛋白量。

2.5酒大黄醇提物与ATS联用对高脂血症大鼠的调脂活性及保肝作用

2.5.1给药剂量设置由“2.2”“2.3”项实验结果可知ATS和酒大黄醇提物的质量比为1∶6.7～1∶9.0时，酒大黄醇提物对ATS所致的L02细胞损伤可发挥较好的保护作用；由“2.4”项实验结果可知ATS和酒大黄醇提物的质量比为1∶35.8～1∶71.6时，联用后对HepG2细胞的调脂作用较强。同时，经查阅文献报道[10-11]和前期预试验摸索，ATS给药剂量为60mg/kg时可使大鼠血清转氨酶水平显著升高，且不会在给药期间引起大鼠的大批量死亡。因此，大鼠ATS的给药剂量设为60mg/kg，根据以上细胞实验配比结果及相关文献报道[9,12-13]，选择酒大黄醇提物超低、低、中、高剂量分别为0.5、2.0、4.0、8.0g/kg。

2.5.2模型制备选取SPF级SD雄性大鼠56只，适应性喂养3d后，随机抽取8只作为对照组，饲喂普通饲料。其余48只饲喂高脂饲料以制备高脂血症模型。每周称体质量1次。造模2周后，随机抽取8只模型大鼠及8只对照组大鼠，眼眶取血，测定血清中TG、TC水平，以模型大鼠血清中TG、TC水平显著高于对照组判定高脂血症模型制备成功。

2.5.3给药方法与分组将造模成功的大鼠随机分为模型组、ATS组（60mg/kg）、ATS＋酒大黄醇提物0.5、2.0、4.0、8.0g/kg（ATS＋VL、ATS＋L、ATS＋M、ATS＋H）组，每组8只。对照组和模型组大鼠均每天ig给予0.5%CMC-Na；ATS组大鼠每天上午ig给予相应剂量的ATS混悬液；ATS＋VL、ATS＋L、ATS＋M、ATS＋H组每天上午均ig给予相应剂量的ATS混悬液，每天下午分别按各自的给药剂量ig给予相应酒大黄醇提物药液。给药期间对照组继续饲喂普通饲料，其余各组继续饲喂高脂饲料，各组大鼠每周均称体质量1次。

2.5.4血液和肝脏样本采集给药4周后，禁食12h，对各组大鼠腹主动脉取血，静置3h后，r/min离心10min，分离血清，于?80℃保存待测。取各组大鼠肝脏，用预冷的生理盐水洗去表面浮血，用滤纸吸去表面残留的生理盐水，称质量，计算其肝脏指数（肝脏指数＝肝脏质量/体质量）。取部分左叶肝脏称质量后，按照各检测指标试剂盒的相关说明进行匀浆化处理，离心后取上清液于?80℃保存待测。取大鼠左叶肝脏，于10%福尔马林溶液中固定48h，进行HE染色制作肝脏组织病理切片。

2.5.5血清相关指标的检测取大鼠血清按照各试剂盒的相关说明操作，通过酶标仪测定其血清中TG、TC、LDL-C、ALT、AST水平。

2.5.6肝脏相关指标的检测取肝脏组织按照试剂盒的相关说明操作，通过酶标仪测定肝脏中TG、TC、MDA含量及SOD活力，并以BCA法测定各样本的蛋白水平。

2.6统计学分析

数据分析采用SPSS16.0分析软件，测定结果以表示，数据比较采用方差分析（One-wayANOVA）或独立样本t检验。

3结果

3.1生、酒、熟大黄提取物对ATS所致L02细胞损伤的保护作用

与对照组比较，ATS组细胞存活率显著降低（P＜0.01）。与ATS组比较，生、酒、熟大黄水提物组细胞存活率无明显提高，而3者醇提物组细胞存活率均有不同程度的提高（P＜0.05、0.01），其中酒大黄醇提物1.00mg/mL组细胞存活率是ATS组的2.5倍，保护作用较好（图1）。

3.2酒大黄醇提物和ATS联用对L02细胞转氨酶水平的影响

与对照组比较，ATS组细胞培养液中的ALT、AST水平显著升高（P＜0.01）。与ATS组比较，酒大黄醇提物0.75、1.00mg/mL组细胞培养液中的ALT、AST水平显著降低（P＜0.01，表2），即0.75～1.00mg/mL酒大黄醇提物可对ATS所致的L02细胞损伤发挥较好的保护作用，因此将其作为酒大黄醇提物联用的保肝剂量，并由此得到ATS与酒大黄醇提物的保肝配比（质量比）为1∶6.7～1∶9.0。

3.3酒大黄醇提物和ATS联用对HepG2肝脂肪变性细胞内TG、TC水平的影响

与对照组比较，模型组细胞内TG、TC水平均显著增加（P＜0.01）。与模型组比较，ATS组、ATS和酒大黄醇提物各联用组细胞内TG、TC水平均显著降低（P＜0.01）。与ATS组比较，ATS和酒大黄醇提物1.00、0.75、0.50mg/mL联用组细胞内TG、TC水平均显著降低（P＜0.01，表3），即酒大黄醇提物0.50～1.00mg/mL和ATS联用对肝脂肪变性细胞的调脂效果较好，因此将其作为酒大黄醇提物联用的有效调脂剂量，并由此得到ATS与酒大黄醇提物的调脂配比（质量比）为1∶35.8～1∶71.6。

3.4大黄醇提物与ATS联用对高脂血症大鼠的调脂活性及保肝作用

3.4.1对大鼠肝脏指数的影响与对照组比较，模型组大鼠肝脏指数显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，ATS＋VL、ATS＋L、ATS＋M、ATS＋H组大鼠肝指数均显著降低（P＜0.05），与ATS组比较，ATS＋M组大鼠肝指数显著降低（P＜0.05，表4）。

3.4.2对血清相关指标的影响与对照组比较，模型组大鼠血清中TC、TG、LDL-C、ALT和AST水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组均能显著降低大鼠血清TC、TG水平（P＜0.05、0.01），ATS＋H组大鼠血清中LDL-C水平显著降低（P＜0.01），ATS组、ATS＋VL组大鼠血清中ALT和AST水平均显著升高（P＜0.01），ATS＋M组、ATS＋H组大鼠血清中AST水平均显著降低（P＜0.05），但ALT水平无显著性差异。与ATS组比较，ATS＋L组、ATS＋M组、ATS＋H组大鼠血清中ALT和AST水平均显著降低（P＜0.01）。综上，ATS和高剂量的酒大黄醇提物联用后降低大鼠血清中TG和LDL-C水平的作用最强，而且能够显著降低大鼠血清中的ALT和AST水平，使其更接近于对照组水平（表5）。

3.4.3对肝脏相关指标的影响与对照组比较，模型组大鼠肝脏中TC、TG、MDA水平显著升高（P＜0.05），SOD活力显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠肝脏中TG和TC水平均显著降低（P＜0.05），SOD活力均显著增强（P＜0.05），ATS＋M组、ATS＋H组大鼠肝脏中MDA水平均显著降低（P＜0.01）。与ATS组比较，ATS＋M组、ATS＋H组大鼠肝脏中TG、TC和MDA水平均显著降低（P＜0.05），SOD活力均显著增强（P＜0.01）。综上，ATS和中、高剂量酒大黄醇提物联用（ATS＋M组、ATS＋H组）均可显著降低大鼠肝脏中TG和TC水平，增强肝脏中的SOD活力，降低MDA水平，使其更接近对照组水平（表6）。

3.4.4对肝脏组织病理学的影响实验结果显示，对照组大鼠肝脏肝小叶结构完整，汇管区无明显异常，肝细胞形态正常，未见明显的病理性改变。模型组大鼠的肝细胞中充满大量脂滴，肝细胞呈严重的空泡性改变且呈弥漫性分布，肝血窦结构消失，炎细胞和Kuppfer细胞浸润灶明显，小叶间胆管增生明显，可见明显的肝脏坏死区域。ATS组大鼠的肝脏脂肪变性仍未得到改善，肝细胞呈空泡状，仍可见明显的炎细胞和Kuppfer细胞浸润灶，伴有胆管增生。ATS＋VL组与ATS组类似。ATS＋L、ATS＋M、ATS＋H均可明显抑制小叶间胆管增生，同时均可一定程度上抑制炎细胞和Kuppfer细胞浸润。综合比较，ATS和高剂量的酒大黄醇提物联用（ATS＋H组）对大鼠肝脏的改善效果较好，镜下无可见的小叶间胆管增生，炎细胞和Kuppfer细胞的浸润情况也得到明显的抑制（图2）。

4讨论

高脂血症患者由于脂质代谢异常[14]，其肝脏的代谢负担加重，肝脏本身即容易出现异常或已存在肝损伤的情况。而临床常用降脂药物ATS存在肝毒性，治疗过程中可能会对高脂血症患者的肝脏造成二次伤害，加重患者肝脏的损伤程度。常用中药大黄具有较好的调血脂、保肝和抗氧化活性，临床常用于治疗肝胆类疾病和血脂异常等代谢类疾病。研究表明大黄对实验性肝损伤有明显的保护作用，可促进胆汁分泌、胆囊收缩、胆道括约肌松弛，从而起到利胆、退黄作用，此外大黄还能抑制胰腺脂肪酶、HMG-CoA还原酶、鲨烯环氧酶活性，增加胆汁的排泄，降低血清TC、TG、LDL水平，延缓动脉粥样硬化。因此，将大黄与ATS联用既能减轻后者的肝损伤副作用，又可增强调血脂的效果，即发挥减毒增效的作用。

本研究通过动物实验研究发现高脂饲料喂养法制备高脂血症大鼠模型，不但会使模型大鼠血脂水平升高，还会使其形成脂肪肝，引起大鼠转氨酶水平的升高，氧化酶水平的降低，以及脂质过氧化反应的发生。这与相关研究中高脂血症可伴发脂肪肝的结果相符，说明高脂血症患者可能伴有脂肪肝的发生，其肝功能本身可能就存在一定程度的损伤，因此对于一些具有潜在肝毒性的药物可能更加敏感，出现肝损伤的风险更高。同时本研究发现应用ATS对高脂血症大鼠进行调脂治疗时确实会引起转氨酶水平的异常升高，存在肝损伤的隐患，这与ATS自身潜在的肝毒性有关，但在一定程度上也可能与高脂血症大鼠的肝脏本身受损后对ATS的敏感性增加有关。因此，ATS虽然是治疗高脂血症的一线药物，但在用于调脂治疗时也需要定期对患者的肝功能进行监测，特别是一些有肝病史的患者需慎用ATS。此外，本研究发现酒大黄醇提物与ATS联用后对于高脂血症大鼠的调脂效果更好，同时酒大黄醇提物对于ATS引发的肝功能异常有着较好的改善作用，中、高剂量酒大黄醇提物与ATS联用可使大鼠肝脏中SOD活力显著增强，MDA水平显著降低，且更接近对照组水平，同时抑制了炎细胞和Kuppfer细胞浸润，这说明酒大黄醇提物可能是通过抗氧化和抗炎机制，抑制氧化应激反应，减轻相关炎症反应，从而对大鼠肝脏发挥保护作用。

本研究分别从细胞和动物水平对大黄不同炮制品提取物与ATS联用的调脂活性和保肝作用进行了研究，筛选出了调脂效果和对ATS所致肝损伤的保护作用均较优的大黄提取物，即酒大黄醇提物，并对其与ATS联用的调脂和保肝作用进行了整体水平的验证，得到了较为理想的联用效果，对今后酒大黄的临床应用和制备方式选择有一定的参考价值，为二者在临床上更合理安全的应用提供了实验依据和指导，也为高脂血症的临床用药提供了更为开阔的思路。但本研究未能明确酒大黄醇提物和ATS联用发挥减毒增效作用的相关机制，而二者联用的具体作用机制还需要进一步深入的研究。

参考文献（略）

来源：赵颖，李冰韶，赵馨雨，刘鑫，王永洁，刘欣妍，余玲，吴清.大黄不同炮制品对阿托伐他汀的增效减毒作用[J].中草药,,50(18):-.